B 细 胞激活因子 （ B cell activating factor,BAFF; 又 称TNFSF13B,THANK,CD257,BLyS 或 TALL1） 是 1999 年发现的肿瘤坏死因子家族中的一员，是与人体免疫有关的细胞因子[1-3].BAFF 由 285 个氨基酸组成，其中 1 ~ 46 位氨基酸为胞内区，47 ~73 位氨基酸为疏水的跨膜区，74 ~ 285 位氨基酸为胞外区。BAFF 位于细胞内的 N 端缺少信号肽，C 端在胞外，属于Ⅱ型跨膜蛋白[1-2.BAFF 主要表达在先天免疫细胞如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞及滤泡树突细胞等。目前已知 BAFF 可与 3 种受体相互作用，分别是 B 细胞成熟抗原（ B cell maturation antigen,BCMA）[4-5]跨膜激活物与亲环素配体相互作用因子（ transmembrane activator and CAML interactor,TACI）[6]及 BAFF 受 体 （ BAFF receptor3, BAFF-R, 也 叫BR3）[7].其中，BR3 是 BAFF 的特异性受体，而 TACI 和 BCMA同样也是 TNF 超家族的另一成员 APRIL 的受体。BR3 是唯一可被可溶性 sBAFF 三聚体激活的受体。同许多 TNF 家族成员一样，sBAFF 多以三聚体型式存在，与其受体相互作用，实现其生物学功能[8].在中性或碱性条件下，20 个三聚体型式的 sBAFF可通过其"Flap 区"相互结合，形成类似病毒颗粒的 60 聚体型式，并可在酸性条件下发生不可逆的分离[9-10].BAFF 的"Flap"环为其特有，其他 TNF 家族蛋白没有此结构。三聚体形式的配体与其受体结合并不一定会激活下游信号通路，尤其是对于TACI,只有 60 聚体形式的 BAFF 才能激活它介导的生物学效应[11].

　　研究发现，BAFF 的异常表达与自身免疫性疾病密切相关。

　　BAFF 表达量的高低影响到 B 细胞的存活信号通路及产生自身抗体的 B 细胞的选择性凋亡[12].普遍认为 BAFF 过表达与系统性红斑狼疮（ systemic lupus erythematosus,SLE） 、类风湿性关节炎（ rheumatoid arthritis,RA） 、干燥综合征（ Sjgren's syndrom,SS） 等多种自身免疫性疾病的发生和发展有着密切关系[13-14].因此BAFF 及其受体有望成为治疗相关性疾病的新靶点。BAFF 可溶性形式为其发挥功能的主要区域，故本研究旨在对 BAFF 胞外区可溶性片段 134 ~285 位氨基酸残基进行克隆，构建原核表达载体。通过 IPTG 诱导蛋白表达，经纯化及复性得到目的蛋白，为体外研究 sBAFF 的结构与功能关系以及进一步探讨其生物学功能奠定基础，并为以 BAFF 与其受体为靶点的药物设计提供新思路。

　　1 材料与方法

　　1. 1 实验材料

　　1. 1. 1 菌种和质粒： 质粒 pET21a; 大肠杆菌 E. coli Top10,E. coli BL21（ DE3） 均由本实验室保存。

　　1. 1. 2 试剂及耗材： DNA 限制性内切酶 NdeI、XhoI,T4DNA 连 接 酶、DNA Marker 购 自 Takara 公 司； KOD DNAPolymerase 购自东洋纺（ 上海） 生物科技有限公司； DNA 凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自申能博彩生物工程公司； 蛋白胨、酵母浸膏购自 Sigma 公司； IPTG 购自 Sunshine 公司； 丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺、TEMED 购 Bio-Rad 公司； Ni2 +-NTAagarose 购自 Qiagen 公司； 透析袋购自南京晚晴公司 （ MW8-10kDa） ; 相关引物由南京金斯瑞生物技术公司合成。

　　1. 1. 3 实验仪器： 高速离心机 （ CR22E,日本 HITACHI 公司） ,超声波细胞破碎仪（ SCIENTZ-II D,宁波新芝生物科技股份有限公司） ,恒流泵（ BT-100,上海沪西分析仪器厂有限公司） ,蛋白质紫外检测仪（ HD-7,南京普阳科学仪器研究所） ,蛋白凝胶电泳仪（ 美国 Bio-Rad） .

　　1. 2 实验方法

　　1. 2. 1 sBAFF 基因的扩增： 根据 GenBank 中编码人 sBAFF的 cDNA 序列，设计一对特异性引物，扩增编码 134 ~285 位氨基酸序列，上游引物 F 为： 5'-GGAATTCCATATGGTTCAGGGTCCAG-3',下游引物 R 为： 5'-CGGCTCGAGCAGCAGTTTCAATG-3'.其中F 和 R 分别含有酶切位点 Nde I 和 Xho I（ 下划线标出） ,引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以 K562 细胞的 cDNA 为模板，PCR 扩增 sBAFF 基因，反应条件为： 95 ℃ 预变性 5 min;98 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,共 30 个循环； 最后 72 ℃ 10 min.PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1. 2. 2 重组表达载体 pET21a-sBAFF 的构建及鉴定： 对PCR 得到的片段及载体 pET21a 分别用限制性内切酶 NdeI、XhoI进行双酶切，利用 T4 DNA 连接酶将 sBAFF 酶切产物连接到pET21a 载体上，并将连接产物转化到 DH5α 感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素的 LB 平板上过夜培养。挑取单克隆，进行菌落 PCR 和双酶切鉴定，鉴定为阳性者提取重组质粒，由南京金斯瑞生物技术公司测序。

　　1. 2. 3 目的蛋白的表达及条件优化： 将测序正确的重组质粒 pET21a-sBAFF 转化进大肠杆菌 BL21（ DE3） 中进行诱导表达。

　　将重组菌接种于含 50 μg/mL 氨苄霉素的 3 mL LB 培养基中，37 ℃ ,220 r / min 培养活化过夜。次日按 1∶100 接种于 50 μg /mL 氨苄霉素的 3 mL LB 培养基中，37 ℃ 、220 r / min 培养至菌体OD600约为0. 6,加入 IPTG 至终浓度1 mM,分别在37 ℃下诱导表达 5 h 和 20 ℃下诱导表达 16 h.诱导结束后取菌液 3 mL,离心去除培养基，PBS 洗涤 2 次后用适量 PBS 重悬。菌液经超声破碎后（ 超声功率400 W,超声2 s,间歇2 s,总时间1 min） ,12000 r/min 离心 5 min,分离上清液和沉淀，沉淀用等量 PBS 重悬。分别取菌液、上清液、沉淀制样，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，分析目标蛋白的表达量和可溶性情况。

　　1. 2. 4 Ni2 +-NTA 亲和层析柱纯化重组蛋白： 确定了目的蛋白适宜的诱导温度和诱导时间后，分别将含有重组质粒 pET21a-sBAFF 的表达菌在 500 mL LB 培养基中扩增培养并诱导表达。离心收集菌体，PBS 洗涤2 次后用40 mL PBS 重悬，冰浴超声破碎直至菌液呈半透明，于4 ℃，12000 r/min 离心 15 min,收集包涵体沉淀。向沉淀包涵体加入 4 mL 含有 8 mol/L 尿素和 10 mmol/LPMSF 的 PBS,于冰上搅拌溶解，4 ℃ ,12000 r / min 离心 15 min,留取上清。首先将 Ni2 +-NTA 亲和层析柱用 Binding Buffer（ 含有 8mol / L 尿素的 PBS） 平衡。以 0. 2 mL / min 的流速缓慢上样，使蛋白能够与柱子充分结合。用 Binding Buffer 平衡柱子 5 个柱体积后，用 Washing Buffer（ 含有8 mol/L 尿素，50 mmol/L 咪唑的 PBS）洗脱杂蛋白。用含有不同浓度咪唑的 Elution Buffer（ 含有 8 mol/L尿素，200/500 mmol/L 咪唑的 PBS） 洗脱目的蛋白。收集各组分的洗脱液进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，分析目的蛋白的洗脱情况。

　　1. 2. 5 蛋白的透析复性： 将透析袋于含 2% NaHCO3和1 mmol / EDTA 的 溶液中煮 10 min,用 ddH2O 冲 洗干净，再于1 mmol / L EDTA 的溶液中煮 10 min,用 ddH2O 冲洗干净。将含有纯度较高的目的蛋白的洗脱缓冲液装入预处理的透析袋中。

　　复性缓冲液由含不同浓度的尿素 （ 6、4、2、1、0 mol/L） 和0. 1 mmol / L PMSF 的 PBS 组成。目的蛋白在 4 ℃ 经上述尿素浓度不断降低的复性缓冲液中搅拌透析，每次 8 h,使变性的目的蛋白在此过程中自然复性，从而得到有活性的目的蛋白。透析结束后，经 SDS-PAGE 凝胶电泳鉴定其复性效果。

　　2 结果

　　2. 1 sBAFF 基因扩增产物的鉴定 以 K562 细胞的 cDNA为模板，设计含有特定酶切位点的特异性引物，对 BAFF 的 134 ~285 位氨基酸进行扩增，预期扩增产物 sBAFF 大小分别约为 468bp.PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶进行电泳后，可见条带清晰单一，片段大小与预期结果一致，结果见图 1.

　　2. 2 重组表达质粒的鉴定 经抗生素筛选和菌落 PCR 鉴定得到阳性重组子 pET21a-sBAFF.质粒载体中含有 T7 启动子序列，采用 T7 引物进行测序。测序结果采用 BLAST 程序进行比对分析，确定与预期相符，成功将"Flap"区进行了有效突变。

　　2. 3 目的蛋白的表达及条件优化 将构建成功的重组原核表达质粒 pET21a-sBAFF 转化大肠杆菌 BL21 （ DE3） 后，在1 mmol / L IPTG 浓度下，分别在 37 ℃ 下诱导表达 5 h 和 20 ℃ 下诱导表达 16 h.经 SDS-PAGE 分析表明，目的蛋白在 2 种不同诱导条件下都得到了有效表达，相对分子量约为 18000,在菌体内主要以包涵体形式存在，见图 2 和图 3.进一步灰度扫描显示，在 37 ℃诱导 5 h 下，目的蛋白 sBAFF 的表达量占菌体总蛋白的32. 16% ,其中可溶的 sBAFF 占菌体上清总蛋白的 19. 02% .而低温 20 ℃诱导 16 h 下，目的蛋白的表达量有所提高，sBAFF 的表达量占菌体总蛋白的 38. 59%,其中可溶的 sBAFF 占菌体上清总蛋白的 30. 89%.说明 20 ℃低温诱导不仅有利于增加目的蛋白的可溶性表达，而且有利于增加目的蛋白的总表达量。

　　2. 4 目的蛋白的纯化 目的蛋白主要以包涵体的形式存在，分离包涵体沉淀后在变性条件进行蛋白纯化。包涵体溶解物经 Ni2 +-NTA 亲和层析柱纯化，得到纯度较高的目的蛋白。对不同咪唑浓度的洗脱收集液进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，结果显示 sBAFF 在 200 mmol/L 咪 唑 洗 脱 下 蛋 白 纯 度 较 高，达 到86. 48% ,见图 4.因而收集纯度较高的目的蛋白进行后续的复性。

　　2. 5 目的蛋白的复性 对收集的目的蛋白采取逐步降低尿素浓度的方法进行透析，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的目的蛋白缓慢地进行自然复性。复性后的目的蛋白经 SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果显示除了 18 kDa 处的条带外，在 54 kDa 处可见第二条条带，从分子量大小估计应为三聚体。因此，复性后的目的蛋白单体形成了有活性的三聚体，见图 5.而凝胶扫描图像的灰度分析显示，经过蛋白复性后有 23. 75%的 sBAFF 聚合成了三聚体。蛋白浓缩后，sBAFF 的三聚体提高到了 38. 14%.最终，目的蛋白总产率为 10. 86 mg/L.

　　3 讨论

　　BAFF 的异常表达与自身免疫性疾病密切相关，故已成为治疗自身免疫疾病的新药物靶点。目前，BAFF 抑制剂主要是针对类风湿性关节炎、SLE 和多发性硬化症三类疾病。随着研究的不断深入，对于 BAFF 形式多样性的理解也更加丰富。BAFF相关 的 抑 制 剂 也 从 最 早 针 对 sBAFF 的 特 异 性 抗体药物Belimumab,发展到其它各种抗体类药物和融合蛋白类药物，如atacicept （ TACI-Ig 融合蛋白 ） 等，再到针对 sBAFF 和膜结合BAFF 的 blisibimod 等。

　　在本研究中，构建了 sBAFF 胞外区的原核表达质粒 pET21a-sBAFF,以期望在体外模拟 BAFF 及其多聚体形式。本文通过摸索不同诱导温度和表达时间，探究不同表达条件对目的蛋白表达的影响，确定合适的诱导条件，以提高目的蛋白的产量。在 20℃ 下诱导表达 16 h,sBAFF 得以有效表达，其表达量显着提高，从37 ℃ 下表达占菌体总蛋白的 32. 16% ,提高到 20 ℃ 下 的38. 59% ,表达量提高了约 20% .由于 BAFF 单体分子量较小，且含有一对二硫键，因此目的蛋白主要以包涵体形式表达。但是与 37 ℃表达相比，降低表达温度可提高可溶性蛋白的含量，从 37 ℃下可溶性占菌体上清蛋白的 19. 02%,提高到 20 ℃下的30. 89% ,可溶性蛋白的表达量提高了约 62. 41% .因此，首先对20 ℃ 下表达的可溶性目的蛋白进行纯化，利用融合蛋白带有 His标签的特征，使用 Ni2 +-NTA 亲和层析进行纯化。
　　
　　然而在纯化过程中，目的蛋白未能有效结合到 Ni 柱上，可能是由于目的蛋白上融合的 His 标签在蛋白折叠过程中被包裹在蛋白内部而未能暴露，从而导致不能有效与 Ni 结合。因此，通过对包涵体进行变性溶解，打开蛋白折叠的高级结构，暴露 His 标签，再使用Ni2 +-NTA 亲和层析进行纯化得到了纯度较高的目的蛋白，为后期研究蛋白活性提供了可能。在对变性蛋白复性透析过程中，采取了逐步降低尿素浓度的方法，使目的蛋白重新缓慢进行正确折叠恢复其生物学活性。而 BAFF 单体内有一对分子内二硫键存在，如果二硫键发生错配，则会产生二聚体及基于二聚体的多聚体形式。同时，有活性的 BAFF 是以三聚体的形式存在的，故在复性过程中，BAFF 单体能否有效聚合成三聚体与其恢复生物学活性密切相关，而有无二聚体存在则能够反映复性过程中是否发生了错误折叠。复性后的 sBAFF 经过 SDS-PAGE 分析显示蛋白主要以单体和三聚体形式存在，有38. 14%的 sBAFF 聚合成三聚体，而代表发生错误折叠的二聚体含量极低，约 1. 21%,这说明本实验的复性工艺是成功的。如何进一步优化复性工艺、获得更高比例有活性的三聚体尚需进一步努力，以取得更加理想的效果。

　　本研究中，sBAFF 的成功构建和表达、以及复性工艺的建立，为进一步在体外研究 BAFF 的作用机制奠定了初步的基础。同时为以 BAFF 为靶点的自身免疫性疾病的新型药物开发创造了条件。